Система технологий всестороннего мониторинга и дифференциальной диагностики ящура — практическое руководство по «выявлению и точной диагностике» ящура 

1. Обзор системы мониторинга: «трёхуровневая последовательность» «клинические признаки — патоген — антитела»

Подход к мониторингу и диагностике ящура соответствует стандарту GB/T 18935—2018 «Методы диагностики ящура» и представляет собой трёхуровневую последовательность, проходящую от клинических проявлений к патогену и далее к иммунному фону:

1.1 Клиническое наблюдение (выявление «подозрительных» случаев). Появление волдырей на рту, носу, копытах и вымени, слюнотечение, хромота, внезапная гибель молодняка — сначала необходимо выявить подозрительные случаи, а затем определить, какие пробы следует взять и куда их отправить.
1.2 Патологическое исследование (уточнение «есть ли заболевание и какой тип»). Сначала проводить тестирование на нуклеиновые кислоты, чтобы определить, положительный ли результат на ящур; при необходимости дополнительно проводить дифференциальную диагностику с везикулярной болезнью; при положительном результате сначала определять серотип с помощью RT-PCR, а затем устанавливать генеалогическую линию с помощью секвенирования VP1.
1.3 Антителловое тестирование (определение «иммунного статуса и источника инфекции»). Разделяется на две категории, цель и сфера применения которых различаются: антитела к структурным белкам (иммунные) позволяют оценить эффективность иммунитета; антитела к неструктурным белкам (3ABC) позволяют определить, имело ли место заражение диким вирусом — используется на фермах, прошедших дезинфекцию, племенных фермах и для отслеживания источника очага.
Эти три этапа не являются просто последовательными: в рамках рутинного мониторинга патологические и антителные исследования проводятся параллельно (у одной и той же партии животных берутся как образцы крови, так и пробы), и только при реагировании на подозрение на вспышку заболевания сначала проводится «подтверждение патогена, а затем — определение антител».
Таблица 1. Сравнение трех основных методов определения антител (в соответствии с GB/T 18935—2018)

2. Клиническое наблюдение и предварительный диагноз

На что обратить внимание и как вести записи. Ящур поражает всех парнокопытных животных; типичные проявления включают волдыри в полости рта, на носовом зеркале, на копытах и на вымях, сопровождающиеся слюнотечением, хромотой и повышением температуры тела; молодняк часто погибает от миокардита («тигровое сердце»). На месте следует обратить внимание на три ключевых признака: ① скорость распространения — ящур распространяется чрезвычайно быстро, уровень заболеваемости высок; ② спектр поражаемых видов — лошадиные не заражаются ящуром; ③ структура заболеваемости и смертности — важной особенностью является внезапная гибель молодняка. Необходимо зафиксировать породы заболевших животных, их количество, дату, локализацию симптомов, а также историю ввоза и транспортировки животных.
Дифференциальная диагностика с другими везикулярными заболеваниями (на клиническом уровне). Везикулярный стоматит, везикулярная болезнь свиней, везикулярная сыпь свиней и инфекция, вызванная вирусом Сенека А, также характеризуются появлением везикул в качестве основного симптома; визуально их трудно различить, поэтому необходимо проводить лабораторные исследования.
Таблица 2. Ключевые моменты дифференциальной диагностики распространенных везикулярных заболеваний

Диагностика на месте основывается на том, наблюдаются ли симптомы у лошадиных (при появлении волдырей у лошадей и мулов ящур практически исключается), а также на скорости распространения и спектре зараженных видов животных; однако клинические признаки позволяют лишь сузить круг подозреваемых заболеваний, но не поставить окончательный диагноз — в стаде свиней ящур практически невозможно отличить от свиной везикулярной болезни и инфекции вирусом Сенека А. Все подозрительные случаи с появлением волдырей следует рассматривать как ящур и немедленно брать пробы для отправки на анализ.
Отбор проб при подозрительных случаях. Предпочтительно использовать кожу вокруг неразорвавшихся или только что разорвавшихся волдырей, а также жидкость из волдырей — в них содержится наибольшее количество вируса, и это наиболее надёжный материал для подтверждения диагноза.
2.1 Кожа волдыря: после промывки PBS отрезать 2–5 г, поместить в 50 %-ный раствор глицерина в PBS (уровень жидкости должен покрывать образец), добавить пенициллин 1000 МЕ/мл и стрептомицин 500 МЕ/мл, закрыть и заморозить;
2.2 Жидкость из волдырей: отсасывают стерильным шприцем в пробирку, добавляют пенициллин и стрептомицин и замораживают;
2.3 Слюна/назальный мазок: применимы в инкубационном периоде или в период выздоровления; окно вирусовыделения в этих периодах длиннее, чем в период появления волдырей;
2.4 O-P-жидкость (секрет пищевода и глотки) у жвачных животных: перед забором образца необходимо соблюдать 12-часовое голодание (пить воду разрешается); дезинфицировать зонд путем замачивания в 0,2 %-ном растворе лимонной кислоты или 2 %-ном растворе гидроксида натрия в течение 5 минут, промыть чистой водой, ввести в верхнюю часть пищевода на глубину 10–15 см, переместить вперед-назад 2–3 раза, затем извлечь; перед каждым забором у нового животного зонд необходимо повторно дезинфицировать;
2.5 Сыворотка/ткани/мазки из окружающей среды: сыворотку у каждого животного отделять стерильно в объеме ≥5 мл, избегая гемолиза; у падельных животных брать образцы миокарда («тигровое сердце»), миндалин и лимфатических узлов; мазки из окружающей среды брать из нескольких точек.
Пять этапов: отбор проб — отправка на анализ — регистрация: ① регистрация идентификационных данных животного и клинической информации; ② классификация проб и присвоение номеров каждой пробе; ③ поместить в 50 %-ный раствор глицерина-PBS или отправить на анализ в охлаждённом виде с соблюдением холодовой цепи; ④ одновременно заполнить форму отбора проб (название фермы, количество животных, дата, показатели анализа); ⑤ оставить пробы в лаборатории для проверки. Только при соблюдении всего процесса можно обеспечить отслеживаемость результатов. Распространённая ошибка: отбирать только кровь, а не пробы из водяных пузырьков на коже — с помощью образцов крови можно определить только антитела, но не поставить окончательный диагноз.

3. Патологическое обследование: подтверждение диагноза «есть ли ящур и какого типа»

Патологическое обследование является основанием для постановки диагноза — для подтверждения заболевания достаточно положительного результата любого из следующих методов: выделение вируса, ELISA на антигены, RT-ПЦР, типизирующая RT-ПЦР, секвенирование VP1 или количественная флуоресцентная RT-ПЦР. В отличие от тестирования на антитела, для которого достаточно взять кровь, для патологического исследования необходимо получить образец патогена (нуклеиновой кислоты). Интерпретация результатов следует основной схеме: сначала подтверждается положительный результат на нуклеиновую кислоту ящура → при необходимости проводится дифференциальная диагностика с везикулярными заболеваниями → после получения положительного результата проводится типизация, а затем секвенирование.
3.1 Первый этап · Тестирование на наличие нуклеиновой кислоты (определение положительного результата на ящур) Обычно используются следующие методы: флуоресцентная количественная RT-ПЦР, мультиплексная RT-ПЦР, изотермическая амплификация (LAMP, RT-RAA), иммунохроматографические тест-полоски с коллоидным золотом, цифровая ПЦР, а также анализ проб окружающей среды (см. ниже). Результаты полевого первичного скрининга с помощью методов изотермической амплификации и тест-полосок с коллоидным золотом в случае положительного результата подлежат подтверждению.
В лабораториях чаще всего используется количественная флуоресцентная RT-ПЦР: она обладает высокой чувствительностью и специфичностью, позволяет выявлять вирус даже в образцах с низкой вирусной нагрузкой на ранних стадиях; результаты готовы через 2–3 часа; значение Ct коррелирует с вирусной нагрузкой и позволяет проводить количественную оценку; значение Ct <35 считается положительным результатом.
Анализ проб из окружающей среды. Отбор мазков со стен, пола, кормушек и фекалий в последние годы подтвердил свою эффективность в качестве дополнительного метода. Оценка на основе модели стада крупного рогатого скота в Великобритании показала, что анализ проб из окружающей среды может выявлять вирус раньше, чем клинические обходы — при отборе 10 проб каждые 3 дня вирус обнаруживается в среднем через 6 дней, что лучше, чем средний показатель в 8 дней, зафиксированный в клинических отчетах о вспышке в Великобритании в 2001 году; однако вероятность обнаружения в отдельном образце низкая, поэтому требуется многоточечный, многократный и непрерывный отбор проб; вирусная нагрузка в окружающей среде достигает пика примерно через 10 дней после заражения, а для подтверждения отсутствия эпидемии на основании отрицательных результатов необходимо проводить непрерывный отбор проб в течение не менее 1 недели.
3.2 Второй этап · Дифференциальная диагностика везикулярных заболеваний (при необходимости) Положительный результат теста на нуклеиновые кислоты напрямую указывает на наличие нуклеиновых кислот вируса ящура и уже является ключевым доказательством подтверждения диагноза; однако везикулярный стоматит, везикулярная болезнь свиней и инфекция вирусом Сеника А также характеризуются везикулами в качестве основного симптома, поэтому в случаях, когда клиническое различение затруднительно или необходимо исключить смешанную инфекцию, необходимо провести дополнительные дифференциальные тесты (особенно в стадах свиней): Разработаны методы одновременного многократного флуоресцентного RT-ПЦР-тестирования для дифференциации ящура и везикулярного стоматита, а также методы двойного RT-ПЦР-дифференцирования вируса Сенека А и вируса ящура.
Дифференциальная диагностика и подтверждение диагноза часто выполняются на одной плашке: при поступлении случаев с волдырями первая плашка мультипл-RT-PCR в лаборатории, как правило, одновременно охватывает ящур и распространённые волдырчатые заболевания, что позволяет как подтвердить диагноз, так и исключить другие заболевания — «при необходимости» не означает, что можно обойтись без дополнительных тестов, а означает, что решение о том, какие именно тесты следует провести, принимается в зависимости от степени клинического подозрения.
3.3 Третий этап · Типизация после получения положительного результата с помощью RT-PCR и амплификации с секвенированием гена VP1 Вирус ящура имеет 7 серотипов, между которыми отсутствует перекрестная иммунная защита. Сначала с помощью типизирующей RT-PCR проводится дифференциация серотипов (O, A, Asia 1, C, SAT 1/2/3, фрагменты 400–730 п.н.). Затем на репрезентативных положительных образцах проводят амплификацию и секвенирование гена VP1 + филогенетический анализ (амплификация с использованием универсальных праймеров, примерно 810 п.н.), чтобы определить генотип и эволюционные связи. Только зная, какой клан циркулирует в данной местности, можно судить о соответствии вакцинного штамма. Анализ структуры эпитопов VP1 становится новым инструментом отбора вакцин, позволяющим перевести «различия в последовательности» в «изменились ли ключевые эпитопы» и на этом основании прогнозировать степень соответствия вакцины.

4. Серологическое тестирование: определение «иммунного статуса и источника инфекции»

Для определения антител достаточно взять кровь; это позволяет ответить на два вопроса разного уровня, связанных с двумя типами антител: антитела к структурным белкам (иммунные) показывают, эффективно ли иммунитет, а антитела к неструктурным белкам (3ABC) — имело ли место заражение диким вирусом. Цели и области применения этих двух типов тестов различаются.
4.1 Антитела к структурным белкам (иммунные антитела): количественное выражение эффективности иммунизации. После иммунизации в основном вырабатываются антитела к структурным белкам, которые являются прямым показателем эффективности иммунизации. Положительный результат у отдельного животного означает, что иммунизация прошла успешно; критерием соответствия для стада является доля соответствующих животных ≥70%; время проведения тестирования — через 21 день после ревакцинации крупного рогатого скота и овец и через 28 дней после ревакцинации свиней.
При проведении теста ELISA контроль температуры имеет решающее значение: это самый легко упускаемый из виду «невидимый убийца». При использовании одной и той же партии из 690 образцов овечьей сыворотки, тех же реагентов и оборудования, при изменении только температуры: при температуре в лаборатории 7 °C и 15 °C результаты теста были недействительными, а при 23 °C — действительными; при извлечении реагентов из холодильника (2–8 °C) без предварительного нагрева результаты были недействительными, а после нагрева в течение 1 часа — действительными; при температуре в термостате 13 °C или при переходе на 25 °C в процессе теста результаты были недействительными, а только при стабилизации температуры на уровне 37 °C — действительными. В результате в одной и той же лаборатории успешность обнаружения антител к вирусу типа А летом превышала 90 %, а зимой резко снижалась до 10 %. Три обязательных требования: ① комнатная температура 20–26 °C; ② оттаивание реагентов в течение ≥1 часа; ③ термостат должен быть предварительно нагрет и стабилизирован на уровне 37 °C перед размещением планшетов.

Можно ли сравнивать результаты, полученные с помощью разных методов? При параллельном тестировании 614 образцов сыворотки степень совпадения результатов методов SPC-ELISA и LPB-ELISA составила 95,3 % для группы O и 96,1 % для группы A; наблюдаются заметные различия в чувствительности наборов разных производителей; данные, полученные с помощью методов LPB-ELISA и VN, также не следует напрямую сопоставлять. Рекомендуется использовать наборы одной и той же марки и проводить проверку качества каждой партии.
4.2 Антитела к неструктурным белкам (3ABC): различение иммунизации и инфекции [для очищенных хозяйств/прослеживания происхождения] После очистки инактивированной вакцины удаляется подавляющая часть неструктурных белков, и иммунизированные животные в основном вырабатывают антитела к структурным белкам; при естественной инфекции вирус интенсивно размножается, и организм одновременно вырабатывает антитела к неструктурным белкам, таким как 3ABC — это и составляет серологическую основу метода DIVA. Именно по этой причине тестирование на обычных откормочных фермах не является обязательным, а основной сферой применения являются фермы очистки и отслеживания происхождения. В соответствии со стандартом GB/T 18935: при косвенном ELISA результат считается положительным при титре ≥0,3, а при блокирующем ELISA — при коэффициенте блокирования (PI) ≥50 %. Существуют данные, указывающие на то, что после многократной вакцинации инактивированной вакциной против ящура частота положительных результатов на антитела к 3ABC может достигать около 10 %, что может мешать дифференциальной диагностике.
Одно важное уточнение. Положительный результат на 3ABC ≠ текущая вирусная экскреция и тем более ≠ статус носителя: это лишь ретроспективный маркер контакта с инфекцией, который необходимо оценивать в совокупности с данными об иммунизации, уровнем антител к структурным белкам, результатами RT-qPCR и эпидемиологической информацией; напротив, на ранних стадиях инфекции результат RT-qPCR может быть положительным, в то время как 3ABC ещё не стал положительным, т. е. это «окно инфекции». Чтобы определить, «есть ли вирус в данный момент», необходимо вернуться к патологическому тестированию.
4.3 Вакцины на основе ВЛП, новые мишени и внедрение на местах Вакцины на основе ВЛП представляют собой самосборные пустые капсиды, образованные структурными белками, выраженными с помощью генной инженерии; они не содержат вирусной РНК, а также неструктурных белков, таких как 3ABC. У иммунизированных животных не вырабатываются антитела к 3ABC, поэтому положительный результат на 3ABC напрямую указывает на инфекцию диким вирусом; при оптимизации схемы вакцинации период защиты может достигать 6 месяцев. Только после смены вакцинной платформы схема мониторинга сможет действительно снизить нагрузку.
Цели и формы тестирования на 3ABC также развиваются: антиген с повторяющимся эпитопом 3B/VPg (чувствительность у неиммунизированных коров 96,8 %, специфичность 99,8 %), ELISA с использованием наноантител (94 %/97,67 %) и латеральный хроматографический тест LFA (95,2 %/100 %) были внедрены один за другим, что позволило решить проблему «совместимости с различными видами и стабильности между партиями», однако полевые методы по-прежнему используются только для первичного скрининга, а положительные результаты требуют подтверждения.

5. Программы мониторинга: как их разрабатывать для различных типов хозяйств

Мониторинг подразделяется на активный (регулярный отбор проб на этапах выращивания, торговли, убоя и т. д. в соответствии с планом для оценки рисков и статуса отсутствия заболевания) и пассивный (экстренное тестирование после поступления сообщения о вспышке заболевания). Частота проведения и набор показателей у этих двух видов мониторинга различаются; что еще более важно, при тестировании на антитела у разных типов хозяйств акцент делается на разных показателях — в обычных хозяйствах проверяются только антитела к вакцинам, а в хозяйствах, прошедших очистку, дополнительно проверяется 3ABC.
Таблица 3. Рекомендации по программам мониторинга для различных сценариев

Примечание: Отбор проб из окружающей среды (со стен, пола, кормушек, мазки из фекалий) применяется для дополнительного мониторинга на племенных животноводческих и птицеводческих фермах, а также в зонах повышенного риска; требуется многоточечный, многократный и непрерывный отбор проб. Ключевые моменты: 1. Необходимо строго соблюдать трехступенчатый подход: клиническое наблюдение для выявления подозрительных случаев → патологическое исследование (положительный результат на нуклеиновые кислоты → при необходимости дифференциальная диагностика → после получения положительного результата типизация и секвенирование VP1) для подтверждения диагноза «есть ли инфекция и какого типа» → анализ антител (иммунные антитела + 3ABC) для определения «иммунного статуса и источника инфекции».
2. Существует два типа антител с разными целями: антитела к структурным белкам (иммунные) позволяют оценить эффективность иммунитета; их анализ обязателен на всех хозяйствах; антитела к неструктурным белкам (3ABC) позволяют определить наличие инфекции диким вирусом и используются для очистки хозяйств и отслеживания источника заражения — на обычных откормочных фермах их анализ не является обязательным.
3. Критерии приемлемости антител: достаточно положительного результата у одного животного; в популяции — ≥70%; тестирование проводится через 21 день после ревакцинации крупного рогатого скота и овец и через 28 дней после ревакцинации свиней.
4. Температура определяет успех или неудачу ELISA: если хотя бы один из трех факторов — лаборатория, реагенты или термостат — не соответствует стандартам, результаты теста считаются недействительными — летом >90 %, зимой — всего 10 %.
5. При подозрении на заболевание в первую очередь следует брать пробы кожи с волдырями или жидкость из волдырей: отобрать 2–5 г, поместить в 50 % глицерин-PBS, заморозить и отправить на анализ; только на основании анализа крови точный диагноз поставить невозможно.
6. Положительный результат 3ABC ≠ текущая вирусная экскреция: это лишь ретроспективный маркер контакта с инфекцией; необходимо проводить комплексную оценку с учетом данных об иммунизации, результатов RT-qPCR и эпидемиологических данных, а также подтверждать результат двумя методами.